新晋诺奖得主团队开发简易新冠病毒检测 不用PCR 可手机定量

来源:药明康德  Tue Oct 13 10:11:41 CST 2020 A- A+

根据世界卫生组织(WHO)的统计,在10月8日-10月10日3天时间里,全球COVID-19新确诊患者数目就增加了100万人。随着北半球秋冬季的到来,控制COVID-19疫情仍然面临着严峻的挑战。快速、准确的核酸检测能够帮助医务工编辑更早发现受到新冠病毒感染的患者,从而对他们进行治疗/隔离和接触者追踪。目前的大部分核酸检测仍然需要将样本送到专门的实验室进行处理,往往需要一天,甚至更长时间才能获得结果,从而可能延误对患者进行治疗和隔离的时间。

因此,科研人员一致在努力开发更快速、更简便的核酸检测。使用CRISPR技术加快检测速度是其中的一个方向。药明康德内容团队此前也报道过著名学者张锋博士率领的团队和他的合编辑们利用CRISPR技术开发简易新冠病毒检测的努力。为了让检测更为快速、简便,张锋团队的STOPCovid检测已经经过不断迭代,不但使用恒温PCR代替了传统PCR,而且删减了纯化RNA的过程,还通过优化步骤提高了检测的灵敏度。

日前,今年诺贝尔化学奖得主之一Jennifer Doudna博士率领的团队和她的合作伙伴在预印本网站medRxiv上发布了一篇论文,基于CRISPR-Cas13a技术开发了一种新型新冠病毒检测。这款检测与众不同之处在于它不需要对病毒RNA使用RT-PCR进行扩增,可以直接定量检测样本中的病毒RNA水平。研究人员还开发了一款基于智能手机相机的检测系统,让医务人员不需要复杂的仪器,就可以在实验室以外的环境中读出检测结果。

不用PCR,提高CRISPR检测的灵敏度

这一检测的核心原理并不难理解。研究人员使用一种叫做Cas13a的酶和与之相结合的CRISPR RNA(crRNA)构成一个复合体。当crRNA与病毒RNA上的特异性序列相结合之后,能够激活Cas13a酶。Cas13a是一种很有趣的酶,一旦被激活,它就会不分青红皂白地切开周围所遇到的任何其他单链RNA分子。利用这种特性,研究人员们在样本里还会添加一种通过RNA相连接的荧光分子。一旦Cas13a得到激活,这种特殊分子上的RNA就会被切断,释放出能够发出荧光的荧光分子。这样通过读取荧光信号,就可以检测到病毒特异性序列的存在。

以前基于这一原理的CRISPR检测为了提高检测的灵敏度,都要对样本中的RNA通过PCR进行扩增。然而这一PCR步骤不但增加了检测所需的时间,也意味着检测数量会受到PCR试剂供给的限制。

▲使用多个靶向不同病毒序列的crRNA能够提高检测灵敏度(图片来源:参考资料[2])

在这项研究中,研究人员采用了另一种方法提高检测的灵敏度。他们推测,既然一个跟病毒特异性序列结合的crRNA能够激活Cas13a酶的活性,那么两个跟不同病毒特异性序列结合的crRNA是否就能更快地激活Cas13a酶的活性,让荧光信号的上升速度变得更快呢?

实验也证实了他们的假设。当研究人员使用两种不同的crRNA激活Cas13a酶时,虽然总共的crRNA水平没有变,但是荧光信号的增长速度明显提高了。通过检测荧光信号的增长速度而不是荧光信号的绝对值,他们发现使用两个crRNA能够显著提高检测的灵敏度。当使用一个crRNA时,检测的灵敏度达到10,000个病毒拷贝/微升,而使用两个不同crRNA时,灵敏度提高到低于1000拷贝/微升。

为了进一步提高检测的灵敏度,研究人员开发了包含3个靶向新冠病毒不同特异性RNA序列的crRNA的检测手段,在检测5个COVID-19患者鼻咽拭子样本的实验中,这一检测准确地发现了这5个阳性样本,而且荧光信号增加的速度与输入样本中的病毒拷贝数有很好的线性关系,进一步证明这一检测可以用于定量测量病毒水平。

利用智能手机的相机构建简易信号读取系统

为了证明这一简易检测能够在实验室以外的环境中使用,研究人员基于智能手机的相机构建了一个简易的荧光信号检测系统。令他们意外的是,这个基于手机相机的荧光信号检测系统的灵敏度竟然比实验室里使用的商业化读板器(plate reader)高出一个数量级。使用这款简易荧光信号检测系统,研究人员只需5分钟就能判断出5位COVID-19患者的鼻咽拭子样本为阳性。

▲基于智能手机相机设计的荧光信号读取系统(图片来源:参考资料[2])

研究人员在讨论部分指出,如今智能手机不但很普及,而且它们的相机灵敏度都很高。更重要的是智能手机通常都携带GPS并且可以联网。这让将读取的结果传输到云端数据库,协助接触者追踪变得更为简便。基于智能手机的新冠病毒检测系统可能在控制目前和未来的大流行方面起到重要的作用。

参考资料:

[1] New test detects coronavirus in just 5 minutes. Retrieved October 12, 2020, from https://www.sciencemag.org/news/2020/10/new-test-detects-coronavirus-just-5-minutes

[2] Fozouni et al., Direct detection of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas13a and a mobile phone. medRxiv, doi: https://doi.org/10.1101/2020.09.28.20201947

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