细胞疗法的发展及生物分析

来源: 澳门新葡京(www.142.net)魔方  Mon Oct 12 10:12:55 CST 2020 A- A+

文 | 阳光德美

2020年新冠病毒爆发,人们在经历了这样一场医疗战役之后,对现今医疗手段有了更多的认识。在漫长的人类进化过程和与疾病的对抗过程中,医疗手段不断的升级换代,从药物治疗、手术治疗发展到了一个新的阶段、新的领域——细胞疗法。细胞疗法作为第三代医疗手段,不论是利用自身细胞抗癌的“过继性免疫细胞治疗”,还是万能的“干细胞疗法”,都展现出巨大的前景。

本文对细胞疗法的发展做一综述,并对细胞治疗产品的特点和临床试验相关检测进行简要先容。

细胞疗法的发展历程

过继性免疫细胞疗法是从患者体内取出具有抗癌能力的T细胞,在体外进行增殖,然后再注射回患者体内,从而达到清除肿瘤细胞的作用。这种疗法不同于常规的放疗、化疗,回注体内的T细胞只针对肿瘤细胞高度特异性清除,对于身体的伤害较小,因此成为目前很有潜力和挑战的疗法。

科学家尝试使用了很多种T细胞来研究,免疫细胞疗法目前也经历了4次技术革新,见图1。

图1 免疫细胞疗法的技术更新

从1976年Morgan等人发现白介素2 (IL-2)对T 细胞的扩增效应并大量生产后,科学家利用IL-2诱导出LAK(Lymphokine Activated Killer)细胞,用于治疗黑色素瘤、肺癌等多种恶性肿瘤。这是最早的过继性免疫细胞治疗方法。但是LAK细胞因为需要依赖大剂量的IL-2,治疗副作用较大,最常见和最严重的毒副作用是出现毛细血管渗漏综合征(CLS),主要表现为全身性水肿和多器官功能失调,可引起胸腹腔积液、肺间质水肿和充血性心力衰竭。

在LAK 疗法后,Rosenberg 等人从肿瘤附近组织中分离出TIL(tumor-infiltrating lymphocytes)细胞。与LAK疗法相比,TIL 疗法具有一定的肿瘤特异性,临床效果优于LAK 疗法,小鼠实验证实其杀瘤效果比LAK高50-100倍。TIL技术体系比较复杂,培养成功率不高,极大地限制了临床应用,但是随着近些年培养技术的发展,相信也会取得很好的临床进展。

1991年斯坦福大学医学院骨髓移植中心报道了具有高增殖力和高细胞毒性的CIK(Cytokine Induced Killer)细胞。CIK技术的出现, 首次摆脱了细胞培养及回输过程中对大剂量IL-2的依赖, 明显减少了患者的临床副反应。在国内,CIK技术大力发展, 已有超过五百家医院将CIK及CIK基础上的细胞治疗技术用于肿瘤患者的治疗, 并证实CIK技术能明显改善患者生活质量, 延长晚期肿瘤患者的生存期。

2010年4月获批的DC(Dendritic Cell)疫苗Sipuleucel-T,是FDA批准的首个治疗性癌症疫苗,就是通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)刺激获得了激活的免疫细胞,DC通过激发机体的免疫功能而抗肿瘤, 属于主动免疫治疗技术。

此后,出现了DC 和CIK 治疗联用,构建出肿瘤特异的杀伤性T 细胞。自此开始,细胞治疗进入了一个“个体化,精准化”的阶段。

图2 DCs与CIK细胞相互作用的简化方案,成熟的DCs还能与NK细胞作用

随着基因技术的发展,科学家尝试以病毒为载体对T细胞进行改造。从患者体内提取T细胞进行体外扩增的同时,向T细胞插入新的基因,增强它们识别攻击肿瘤细胞的能力。

TCR-T (T-cell receptor engineered T cells)是利用患者自身的外周血T 细胞,通过基因修饰将针对肿瘤相关抗原的TCR 序列转入T 细胞中,成为肿瘤抗原特异性T细胞,是针对不同患者肿瘤抗原的差异所进行的“个体化”治疗。但是由于TCR-T是主要组织相容性复合体(MHC)限制性的,仅能用于患者自身的治疗,这限制了TCR-T 临床应用的延展性。

此后应运而生的CAR疗法的原理与TCR疗法相似,通过基因转导使患者的T细胞能够表达嵌合抗原受体CAR,将改造后的T细胞回输至患者体内,生成大量特异性识别肿瘤的CAR-T细胞从而杀死肿瘤细胞。CAR-T细胞是以非MHC限制性的方式识别肿瘤细胞的,因此得到了更广泛的应用。到目前为止,CAR 载体构建已发展到第4 代,具有更好的特异性。

图3 CAR的结构示意图

抗CD19 CAR-T在血液系统恶性肿瘤的研究上取得了令人瞩目的成绩,已于2017年正式在欧美国家上市。4月21日,药审中心(CDE)官网显示,国内的首个靶向 CD30 的自体 CAR-T 细胞疗法获批临床。

图4 全球获批CAR-T治疗产品

如今,除CAR-T外,很多免疫细胞如NK细胞、γδT细胞和DC等也是治疗肿瘤的理想选择,并且也与基因改造技术结合起来成为肿瘤免疫细胞治疗研究的新方向。

干细胞疗法的研究始于20世纪60年代,加拿大科学家Ernest A. McCulloch 与 James E. Till在1963年首次证明了血液中干细胞的存在,造血干细胞可以分化成多种细胞。

图5 造血细胞谱系的应用和疾病治疗潜力

1967年,美国华盛顿大学的E. Donnall Thomas完成第一例骨髓移植治疗造血功能障碍,此项研究于1990年获得诺贝尔医学和生理学奖。1998年,人类胚胎干细胞在体外生长和增殖成功。1999年,Goodell等人发现小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化”为血液细胞,这打破了用于临床治疗的干细胞只能来源于胚胎或受精卵的限制,为干细胞治疗疾病提供了新途径。1999 年以来,干细胞与再生医学领域研究成果先后11 次入选Science 杂志年度十大科技突破,彰显出科学界对该领域的高度重视。另外,在利用干细胞构建组织、器官方面,科研人员已经在体外利用干细胞培养获得“微型器官”,构建了肝脏、脑和肾脏。

干细胞疗法主要基于成体干细胞的3大理论:1)干细胞具有无限繁殖能力和向所有细胞转化的能力;2)干细胞通过其产生的外泌体和生长因子实现对近乎所有组织器官细胞的转化再生替代和修复重建功能,从而改善器官功能;3)经过对干细胞的基因“修饰”能提升其对靶向细胞的修复能力和有效性控制能力。2007年日本科学家对诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的成功研究结果完全颠覆了对生命以及干细胞的传统认知,绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍,成为了干细胞研究的新热点,并形成了干细胞疗法第4理论:用特殊手段诱导成体细胞逆转成为具有胚胎干细胞分化功能的细胞,即iPSC理论。

临床上研究较多的干细胞治疗的疾病有白血病、恶性贫血、再生障碍性贫血、肝硬化、克罗恩病、小儿自闭症、脑瘫、帕金森症、阿尔兹海默症、糖尿病、糖尿病足、系统性红斑狼疮、关节炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病、急性心肌梗死、肿瘤等,涉及面可谓多样化。这种疾病治疗的多样性,是由干细胞治疗机制的复杂性决定的。

图6 干细胞技术的应用多样性

目前全球有 13种干细胞产品获批上市,涉及的适应症包括膝骨关节炎、心血管、移植物抗宿主病、克罗恩病等,我国在干细胞领域的研究也位于世界前列,尤其是在间充质干细胞的研究上,虽然很多都还处在临床I、II 期,但未来可期。

图7 已获批的干细胞产品(数据截止2020.3)

就现在公开的文献资料来看干细胞临床研究主要集中在造血干细胞(HSC)和间充质干细胞(MSC)上,近些年神经干细胞(NSC)和多能干细胞(PSC)也被认为有很好的发展前景。

有研究尝试通过流产胎脑和自身骨髓或脐带血间充质干细胞诱导分化获得神经干细胞,来治疗神经胶质瘤、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、慢性脊髓损伤和中风等神经损伤疾病,相关研究最快的也还处在临床II期。

诱导性多能干细胞iPSC由于基因编辑而产生的致瘤风险临床应用较少。目前报道的iPSC对角膜修复、心脏病治疗和帕金森治疗的研究上取得了一定的进展,但还需要大量的临床研究才能看到存在的问题。

造血干细胞研究的适应症主要是血液系统的恶性肿瘤,这类研究报告的不良反应较多,多数与合并使用的放化疗和移植前的预处理有关;另外由于移植时采用异体细胞,易出现急慢性移植物抗宿主病(GVHD),并影响患者预后。但近年来也有人用自体造血干细胞尝试治疗一些肝脏和缺血性疾病等,不良反应报告相对较少。

间充质干细胞是除造血干细胞外开展临床研究最多的干细胞类型, 我国在间充质干细胞上的研究已经非常领先了。间充质干细胞在动物试验中,具有良好的安全性和低免疫原性,未见明显的毒性反应和致瘤性,因此应用广泛。在新冠肺炎爆发期间,干细胞治疗也被用于重症新冠病毒肺炎的治疗,并且在临床效果上取得了可喜的结果,间充质干细胞对免疫系统的双向调节作用对新冠肺炎重症患者出现的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)有积极作用。很多病人由重转轻,甚至治愈。这让大家对干细胞治疗技术有了极大的信心。

目前干细胞制剂还没有统一的质量标准,因为干细胞表面的标志物有时不稳定,这造成了干细胞鉴定和分类的困难。在数量上,用于临床治疗的干细胞也不能无限扩增,因为随着扩增次数的增加,基因突变会逐渐积累,这增加了遗传风险。有鉴于此,干细胞相关法规亟待进一步完善,各国的监管部门、美国FDA 以及我国国家卫生和计划生育委员会、国家食品药品监督管理局,都对干细胞研究技术制定了相应的引导原则,以支撑细胞治疗产业的发展。

细胞治疗产品的特点

如今细胞治疗的前沿发展方向都与基因编辑技术结合起来如CAR-T,iPSC等,使其不仅具有细胞产品的特点还兼有基因产品的特性。与研究成熟的小分子相比,细胞和基因治疗的一些产品相对缺乏临床经验。很多文献中的临床数据多是小样本、单中心,由于试验人群的特殊性,对于可能与特定类型的细胞和基因治疗产品相关的安全性可能存在相当大的不确定性。此外,一些细胞与基因治疗产品在单次给药后可在人体中持续较长时间,或即使在产品本身不再存在后仍有较长时间的效果,且产品的效果可能会随着时间的推移而变化。

细胞治疗产品的治疗方式是多样的,可能是静脉输注,也可能需要手术或其他侵入性操作才能到目标部位。那么手术增加的风险也可能是整个治疗风险的一个重要组成部分。

另外,对于异基因细胞治疗产物、基因治疗载体和可能由细胞和基因治疗产物产生的蛋白质具有诱发免疫原性的可能。一是已经存在的抗体,或在给药后产生的抗体可能会减少或消除正向效果,引起不良反应(如自身免疫综合征),或影响安全性或在有后续给药时降低疗效。二是对于那些可以用细胞、组织或器官移植来治疗的患者,可能会产生排异反应而影响移植。

细胞治疗产品的生物分析

对于细胞治疗产品,可能在细胞膜上呈现多种分子,并表达多种因子,(比如,国际细胞治疗学会定义干细胞,要求超过95%的细胞表达细胞表面标志CD105、CD73、CD90、CD44、CD29,绝大多数不表达造血细胞表面标志CD31、CD45、CD34、CD14、CD11b,CD79a及CD19等,也不表达MHCⅡ类分子)。这些分子和因子可能受到微环境的影响,并随时间发生变化。细胞在体内可能分化成不需要的细胞类型。细胞也可能向其他方向发展治疗功能,干细胞可能发展成多种成熟的组织类型,可以进行转换,并开始形成肿瘤。细胞治疗产品还可能是多种细胞类型的混合,比如免疫细胞群,并且可能不清楚哪种细胞类型是起效的主要类型。

另外,细胞治疗产品的全身递送可能导致细胞分布到身体的各种组织,即使是移植到特定组织或器官的细胞也可能会迁移到意想不到的位置,此时检测细胞的转归与追踪也具有挑战。细胞治疗产品的表型鉴定监测及分型计数分析都需要流式细胞术(FCM),阳光德美采用4激光11色流式细胞仪,结合多维流式分析技术可以支撑更全面的细胞表型及分型分析。

而基因治疗产品,被传递基因的表达可能是不受控制的,并干扰受体中关键酶、激素或其他生物过程的正常功能。一些基因治疗产品是设计成整合到受体细胞的DNA中长期表达,这种基因组的改变可能导致邻近基因的激活或失活,从而产生良性或恶性肿瘤。

对于基因修饰的细胞,或体外基因治疗产物,是将基因导入体外细胞,然后将修饰后的细胞注入受试者体内的产物。这类产品既有基因产品的特点,也有细胞产品的潜在风险。

鉴于细胞和基因治疗产品的特殊性和复杂性,早期临床试验不仅要评估特定剂量水平的安全性,还要评估如给药的可行性和药物的活性等其他问题。大家在检测中也需要对产品的生物学特性有一个适当的理解,以便开发效力检测,并且需要收集足够的产品特性数据,即在整个临床前和临床开发过程中(包括分子、生化、免疫学、表型、物理和生物学特性)来引导和完善方法,在临床试验设计上都要全面的考虑。

对于每一种细胞治疗产品,在体外刺激、定向诱导和基因改造过程中都要对其标志物或基因进行检测,在临床检测中也需要尽可能地评估细胞产品的作用机制以及药效。如靶向CD19特异性CAR-T细胞的动态变化已经通过流式细胞术和定量PCR技术得到了广泛的研究。流式细胞技术主要是检测细胞表型和分型,而阳光德美采用的qPCR主要是针对CAR基因阳性T细胞以及CAR基因拷贝数。尽管由于CAR转基因的沉默,会导致PCR的检测偏差,但文献报道这两种方法的结果有很好的相关性。研究表明,CAR-T细胞的移植和输注后的持续与临床疗效相关。CAR-T细胞由于细胞重新分配到组织中而在输注后的24~48小时内迅速下降,之后2周内达到CAR-T细胞浓度的峰值,且到达峰时含有大于80%的循环T细胞,之后CAR-T浓度随后下降;然而,这种下降的速度在个体之间是可变的,数周到数月的时间内不等。CAR-T细胞浓度随时间变化的曲线在28天内的峰值浓度和面积与治疗后的临床反应高度相关。

图8 外周血CAR - T细胞动力学

与此同时针对CAR-T引起的细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性,还需要检测多种细胞因子或biomarker,以便更好地阐明其作用机制和药效。阳光德美有多个分析平台如MSD、Simoa等,在检测细胞因子和biomarker上都具有更高的灵敏度与准确度,可以提供更多的选择。美国血液与骨髓移植学会(ASBMT)也提出了一个关于CRS和神经毒性的评估分级系统来引导临床研究。

结语

细胞治疗已经成为现代医疗的热点,免疫细胞对于多种癌症的治疗和干细胞对于疑难症和罕见病的治疗有望达到“治本”的目标。目前细胞治疗临床研究百花齐放,临床试验科学合理的开展也给大家带来了新的机遇与挑战,在细胞治疗临床研究相关的检测与评价上大家可以提供更全面、规范的分析方案及更多的分析检测。未来细胞治疗将会成为一个标准化、规范化的常规医疗手段被广泛接受与应用,对于细胞治疗产品的临床检测也会有更高的要求,相信未来会有更多的细胞治疗产品为患者带来希翼。

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